之前介绍了如何选择研究的miRNA(文章名称:《研究miRNA,到底是研究5p成熟体还是3p成熟体呢?》)以及miRNA表达量的检测方法(文章名称:《茎环法or加尾法?哪种更适合你的miRNA检测?》),这次小编来讲讲miRNA过表达和干扰的常用研究方法。
【资料图】
miRNA作用机制
miRNA首先在细胞核内转录出较长的初级miRNA(pri-miRNA),然后在细胞核内由Drosha加工成前体miRNA(pre-miRNA),在Exprotin 5复合物的帮助下被转运出细胞核,在细胞质中由Dicer剪切成为成熟的miRNA(mature-miRNA),随即被整合进RNA沉默复合物(RISC)中,基于与mRNA完全或不完全配对来调节基因表达。
图1 miRNA作用机制
miRNA过表达
研究miRNA过表达通常有三种方法:(1)根据pri-miRNA序列构建过表达载体,选择pre-miRNA上下游在内的300bp以内的序列克隆到启动子下游;(2)根据mature-miRNA序列构建过表达载体,将mature-miRNA序列及其反向互补序列加上loop序列构建到载体上;(3)直接化学合成小片段mimics(mature-miRNA序列)。
其中,根据pri-miRNA序列构建过表达载体,载体转入细胞或实验动物体内后可利用miRNA加工机制获得成熟的miRNA并发挥作用,过表达效果较好,是最常用的一种过表达方法。
表1 miRNA过表达的研究方法
miRNA干扰
研究miRNA干扰通常有三种方法:(1)antango,合成mature-miRNA序列的反向互补序列构建到载体上;(2)sponge,一般是将4个mature-miRNA序列的反向互补序列用linker连接,合成相应序列,构建到载体上;(3)inhibitor,直接化学合成mature-miRNA反向互补序列。
sponge有多条mature-miRNA反向互补序列,相比单条序列,干扰效率更高,且II/III型启动子均可启动,使用范围更加广泛,是最常用的干扰方法。
表2 miRNA干扰的研究方法
注:由于miRNA干扰只是利用反向互补序列吸附miRNA,而非让miRNA降解,所以miRNA依然存在,使用qPCR检测其表达量没有变化是正常现象,可通过检测与其相互作用的靶基因的表达量来判断miRNA表达量是否下降。
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